核酸荧光染料 不光灵敏，更要安全[选购宝典]

由于只需简单温和的物理方法（光照）激发和检测，荧光染料是研究生物学微观世界特别是核酸时最常用的示踪工具之一。这里的荧光核酸染料主要指能特异结合核酸并改变发光特性的化合物，DNA电泳后检测凝胶的EB大概是最为人熟知的荧光核酸染料吧。除了染胶，荧光核酸染料还可用于荧光原位杂交中作为常见的复染剂，它们能以非共价键的方式与DNA/RNA结合从而显示原位杂交中的细胞背景信息。根据它们能否穿透细胞膜进入活细胞体内，还可分为两大类：通透性核酸染料和非通透性核酸染料。生物通在此简单比较一下在分子生物学实验和细胞学实验中常用的荧光染料。 分子生物学常用荧光核酸染料 荧光核酸染料在分子生物学最常见的应用无疑是电泳凝胶染色，以及定量PCR。 EB EB（溴化乙锭）本身在紫外下不发光，能与单链、双链甚至三链DNA高效结合并发出明亮的橙色荧光。因其廉价且灵敏度高，一直是琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。EB的使用非常简单方便，电泳结束后染色可获得最佳效果，也可以在制胶时加入进行前染。前染有利于节约时间，但是易出现条带变形拖尾等问题。EB-DNA结合物会导致染料的光漂白和DNA单链断裂，且具有潜在的诱变作用。虽说以前的实验室里总会有个别做起实验来“精神可嘉，行为可怕”的家伙，一时找不到手套他们敢徒手拿EB胶，但大多数人对EB还是“敬而远之”的，没事谁都不愿靠近实验室里跑胶、看胶那一块地方。偏偏对于搞分子生物学的人来说，跑胶就像吃饭一样平常，于是大家只能硬着头皮天天和EB打交道，盼望EB的替代品早点出现在实验室。生物通在此简单回顾一下这几年纷纷登场的EB替代品。 SYBR系列染料 说到EB的替代物，首先想到的是Invitrogen旗下Molecular Probes专利持有的SYBR系列。自1993年SYBR核酸染料推出以来，就因其灵敏度和易用性而迅速大受欢迎，成为明星产品之一。这一系列包括4种染料：SYBR Safe、SYBR Gold、SYBR Green I和SYBR Green II。 赫赫有名的SYBR Green I荧光染料是最早上市的EB替代品，这种致畸性低而相对安全得多的新染料在标准300 nm的紫外透射光下，能检测低至60 pg的dsDNA，比EB至少高了一个数量级。同时，SYBR Green I染料-DNA复合物的荧光量子产率约为0.8，相当于EB的5倍。SYBR Green I的使用和EB同样简单，而具有比EB更高的灵敏度，致变性也低得多（有个别宣传称之为几乎无毒），使之迅速成为替代EB的好选择----如果不是贵得多的话就更好了。色如其名，结合DNA后会发出美丽的绿色荧光，在拍照时需要配套的滤光片。SYBR Green I亦即是定量PCR荧光染料法中广泛使用的荧光染料。为什么选择它，而不是灵敏度更高的SYBR Gold呢？那是因为SYBR Green I具有双链DNA的专一选择性。 SYBR Green II与SYBR Green I则刚好相反，它是检测RNA或单链DNA的高灵敏染料。尽管它不是RNA特异的，但SYBR Green II与RNA结合的荧光量子产率（~0.54）高于DNA（~0.36）。这个性质很特别，因为大部分染料都是与双链DNA结合时量子产率和荧光强度更高。与SYBR Green I相似，SYBR Green II也是在254 nm透射光下灵敏度最高。如果在300 nm透射光下，RNA检测的金牌恐怕还要颁给SYBR Gold。此外，SYBR Green II染料-RNA复合物的荧光不会被尿素或甲醛淬灭，因此在染色之前不必将变性剂洗脱。SYBR Green II可检测凝胶中低至100pg的ssDNA或者2ng RNA条带，特别适合SSCP分析和RNA分析。 SYBR Gold是这一系列中灵敏度最高的。它一旦结合核酸，荧光会增强1000倍以上，量子产率约为0.6。而EB仅为30倍，量子产量大约在0.15。因此，利用300 nm紫外透射仪和黑白成像，SYBR Gold检测凝胶中DNA和RNA的灵敏度比EB高10倍以上。色如其名，可以观察到金色的条带。SYBR Gold染料可用于检测包括双链DNA，单链DNA和RNA，适用于琼脂糖凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、单链构象多态性（SSCP）研究，以及其他常规的分析。 SYBR Safe既然名为safe，自然是安全第一。它的诱变性比EB要低得多，但检测灵敏度与EB相当。使用方法也相同，既可以在制胶的时候加入，也可以在电泳后进行染色。SYBR Safe的激发峰在280和502 nm，发射峰在530 nm。因此，核酸被染色后，可通过标准的紫外透射仪、可见光透射仪或激光扫描仪来查看。大家都知道，紫外光对DNA片段是有损伤的，Invitrogen曾做过实验，让1.25 kb的基因片段在紫外光下暴露2分钟，再切胶回收、连接、转化，结果发现平板上的克隆数几乎为零。如果你用SYBR Safe搭配蓝光透射仪，就不会有这种问题，也无需担心紫外线对眼睛的损伤。 生物通小贴士：SYBR染料虽是EB的替代，但用法和EB不尽相同，染色时也有一些需要特别注意的地方。首先是pH值。Invitrogen的专家发现pH是影响染色效率的重要因素。如果它高于8.3或低于7.5，你会发现灵敏度显著下降。另外一点也很容易忽视，Tris缓冲液的pH值在4°C会比室温下明显升高。如果在室温时你的缓冲液配制成pH 8.0，那么在4°C pH将会升高到8.5。因此如果你要冷藏染色液，那么它在室温下的pH值应是7.5。 其次，很多研究人员习惯于制备含有溴化乙锭染料的凝胶。SYBR Green染料也能如此使用，不过核酸的迁移率会受到影响，灵敏度也会稍有下降，因为背景荧光增加。在预制胶时，染料应该在临灌胶之前，液体足够冷却时加入熔化的凝胶中。沸腾和接近沸腾的温度会破坏SYBR Green染料染核酸的能力。注意：不要在微波炉中加热SYBR Green染料。 Lonza公司也有一种久负盛名的类似SYBR Gold的GelStar核酸荧光染料，可高灵敏的检测凝胶中低至20pg的dsDNA或者3ng的RNA，使用起来和EB一样可以前染或者后染且无需脱色，可让你更清晰地观察实验结果。 UltraPower核酸染料 百泰克公司最近也推出了一种取代EB的无毒花菁染料- UltraPower核酸染料。利用紫外凝胶透射仪来观测，它的灵敏度比EB染色法高5-10倍，如果配合百泰克UltraPower™可见光透射仪，则比EB染色法高8-20倍。样品荧光信号强，无背景信号。操作也很简单，可以采用胶染法（同EB）、点染法、泡染法等染色方法，无须脱色或冲洗。琼脂糖凝胶电泳和PAGE电泳均可使用，价钱当然比进口试剂要便宜很多。目前，百泰克还提供试用装，欢迎大家申请。 GelRed & GelGreen 由中国留学生创立的美国Biotium公司提供的GelRed和GelGreen也是EB替代品。根据独立的测试服务公司的标准艾姆斯氏测试结果，在 18.5 μg /mL （该浓度远高于推荐用于电泳后染色的约 4 μg/mL 的 3X 染色液）浓度下，GelGreen 没有诱变性，而GelRed 也仅在 S9 代谢活化时有微弱的诱变性。GelRed 和 GelGreen 的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞，正是这一特性降低了染料的细胞毒性。如果您使用的是紫外成像仪，可选择GelRed；如果您使用激光成像仪或希望在可见光下观测，可选择GelGreen。 插曲：争议 网络上关于EB替代品安全性的问题一直争论不休，虽然各品牌都有五花八门的证据，但EB替代品究竟安不安全？虽然EB为活细胞排斥，但还有具有一定的细胞膜通透性，EB的致变性通常被认为来自于能稳定地插入到核酸中而导致核酸复制过程出错。每种荧光核酸染料都因其能稳定插入核酸内部从而改变荧光特性才得以成为可用的荧光染料，从理论上都是不安全的，新出的EB替代物的安全性恐怕还需要更长时间来验证。其实长期在实验室里工作真可谓“冒着生命危险”的，常常需要与EB啊，同位素啊，细菌病毒啊等各种致癌致畸的试剂打交道。2007年生物通曾经联手赛默飞世尔公司发起过实验室安全调查，正是有感于短期内多次听到同领域多位人士患可怕重症的消息，调查结果也确实触目惊心。因此，无论用什么，请大家还是牢记----珍爱生命，请带手套。一时半会儿看不出问题，可年轻的你们，来日方长呢……实验室安全的问题，我们一直不够重视，但有关自己的健康，你还能忽视吗？还有各种染料染色后继的废弃试剂，请尽可能的规范处理，请做个负责任的实验人----通常的处理是活性炭吸附后焚化，就算没有条件也尽可能处理一下（比如强碱处理，多数荧光染料会变性）再废弃，我们的环境污染实在不需要我们雪上加霜了。 言归正传，荧光染料在分子生物学中另一个广泛应用就是定量PCR。关于荧光探针和荧光引物的选择及优缺点比较，那又是一门大学问，详情请看《定量PCR选择之：荧光探针和荧光引物》。 细胞生物学常用荧光染料 固定细胞的染色 PI PI（碘化丙锭）与EB结构相似，PI在水中的溶解度更高，而膜通透性比EB低，不过两种染料都会被活细胞排斥。PI则常用于检测死亡或即将死亡的细胞数量，或了解细胞内染色体局部状况、DNA结构和膜完整性。PI作为红色荧光复染剂的首选，可与绿色荧光探针或二抗共同使用。 DAPI荧光染料 DAPI大家应该也不陌生。它的学名为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，与DNA结合后发出蓝色荧光，与其他结构的绿色、黄色和红色荧光形成鲜明的对比。与Hoechst相似，DAPI也是与双链DNA的小沟结合，特别是AT簇。当它与双链DNA结合时，荧光强度增强20倍，而与单链DNA结合无荧光的增强。它的荧光强度比Hoechst低，但光稳定性高于Hoechst。不过，DAPI在结合去污剂、磷酸盐及其他多聚阴离子之后，荧光并不会显著增强。DAPI是一种极佳的核酸复染剂，能显示出染色体的清晰带型。DAPI易溶于水，在PBS中溶解度有限。 SYTOX系列染料 Invitrogen的SYTOX系列染料也很受欢迎，它们是非通透性的花菁染料，尤其适合于死细胞的染色。使用起来也比较简单，只需要加到细胞，然后观察即可，不需要额外的洗涤，因为它们在水溶液中没有荧光。SYTOX染料适用于多个平台，包括荧光显微镜、流式细胞仪和酶标仪。整个系列目前有红、橙、黄、绿四种颜色。 SYTOX绿色染料与核酸的亲和力是整个系列中最高的。一旦与核酸结合，荧光会增强500倍以上。哇，立马把PI比了下去。且它的碱基选择性最小，不像DAPI和PI那么挑剔，只认AT。SYTOX绿色染料可由常用的488 nm激光或其他的450-490 nm光源激发。它能轻松地透过质膜受损的细胞，但不能穿过活细胞膜。它还特别适合于革兰氏阳性菌、阴性菌及某些病毒粒子的染色，因为它很亮。SYTOX绿色染料能与红色、蓝色染料一起，进行多色分析。它还能与SYTO 17红色染料进行死细胞和活细胞的共同染色。 SYTOX蓝色染料也是一种高亲和力的核酸染料，只能渗透质膜受损的细胞。它与核酸结合后的最大吸收峰约为445 nm，能被汞弧灯的436 nm谱线所激发。与许多蓝色荧光染料不同，SYTOX蓝色染料还能被卤钨灯有效激发。在定量膜受损的细菌细胞上，SYTOX蓝色染料与绿色染料效果相当，同样也不会干扰细菌细胞的生长。不过蓝色和绿色的发射光谱有些重叠，因此SYTOX蓝色染料还是与橙色或红色探针一起使用，效果更佳。 SYTOX橙色染料能清晰分辨死的细菌、酵母或哺乳动物细胞。它与PI相比，发射波长更短，它的光谱则更接近罗丹明的滤光片。此外，SYTOX橙色染料的消光系数比PI要高得多，在结合DNA时荧光显著增强，表明它作为死细胞染料或核酸复染剂，有着更高的灵敏度。SYTOX橙色染料还是利用流式细胞仪进行DNA片段筛选时的最佳染料。 活细胞的染色 Hoechst荧光染料 大家耳熟能详的Hoechst系列染料是一种双苯甲亚胺（bisbenzimide）染料，主要有Hoechst 33258和Hoechst 33342等。它们是细胞膜通透性的小沟结合DNA染料，结合后发出明亮的荧光。Hoechst 33342的膜通透性比Hoechst 33258略好，相当易溶于水，细胞毒性小。它们可被大多数常用的荧光光源所激发，表现出相对较大的斯托克斯位移（激发/发射波长约为350/460 nm），因此适合于多色标记实验。在未结合DNA时，它们有着复杂的pH依赖光谱，在pH5时的荧光产量比pH8时要高得多。SDS等表面活性剂还能使荧光增强。 Hoechst染料普遍用于多个细胞分析，包括细胞周期和凋亡研究，而且它们还是常用的核酸复染剂。此外，Hoechst 33258还有一个特殊的应用。由于它对疟原虫有毒性，因此可用于血液样本的流式筛选，并评估患者的药物敏感性。 SYTO核酸染料 Invitrogen的SYTO是活体核酸透性染料。这种染料对核酸的亲和力较低，可通过被动运输扩散透过大多数细胞的细胞膜。对活细胞和死细胞的DNA和RNA都可以进行染色。同时，也可用于革兰氏阳性和阴性细菌的染色。染料通过紫外光或可见光激发而发出荧光。目前有蓝、绿、橙和红等几种颜色。各种SYTO染料间的特性都不相同，包括细胞通透性、与核酸结合后荧光的增强度、激发和发射光谱、对DNA/RNA的亲和力等。与专门用于DNA染色的DAPI和Hoechst染料不同，SYTO还可以对RNA进行染色，因此，经过SYTO染色的细胞在细胞核和细胞质中都可以观察到染色。 由于有些SYTO染料在中性pH条件下带正电荷，因此也可以对线粒体染色。死亡的酵母细胞经过染色后出现明亮的荧光，活的酵母细胞在线粒体和细胞核都可以观察到荧光。一些SYTO的染色还可以用于观察细胞凋亡。红色的SYTO染料可以用来作为绿色荧光蛋白、凝集素或者非通透性绿色SYTOX染料的复染剂。一些绿色的SYTO染料则是很好的细胞核复染剂。 此外，Invitrogen还提供了很多种花菁染料，这里就不一一详述了。如果你想了解更多，或有特殊的应用，请点击此处索取资料。（生物通 余亮 吴青） 相关阅读： 荧光知识充电站 蛋白荧光染料大比拼 五花八门的细胞器探针 荧光蛋白的过去、现在和未来