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嘉荧健康知识 2024-12-19 1 576

来源：时间：2023-11-10 15:25:47

免费医学论文发表-固有的无序区域不足以指导核仁蛋白在细胞核中的区室定位

抽象

核仁是一种非膜结合的细胞器，对核糖体生物发生至关重要。核仁含有蛋白质和 RNA 的混合物，并具有 3 个已知的核仁区室：纤维中心（FC）、致密纤维成分（DFC）和颗粒成分（GC）。核仁的空间组织受核仁蛋白的相分离特性、RNA 的存在、蛋白质修饰和细胞活性的影响。许多核仁蛋白似乎集中在隔室的边界内。我们研究了来自几种蛋白质的内在无序区域是否提供了使用非洲爪蟾卵母细胞建立特定区室定位所需的信息。对于我们测试的蛋白质，无序区域不足以指导特定的结构域定位，并且在区室化方面似乎是可有可无的。在共定位到 DFC 的蛋白质中，有构成盒 H/ACA 假尿苷化复合物的四重奏。与 IDR 不足以直接区室定位相反，我们发现 2 个 box H/ACA 蛋白 Gar1 和 Nhp2 的 DFC 积累被先前证明会降低其加入 box H/ACA 复合物的能力的突变破坏。使用纳米抗体将新结合引入不同的DFC定位蛋白，我们恢复了Gar1和Nhp2突变形式的定位。

数字

Fig 4Fig 1Fig 2图3Fig 4Fig 1Fig 2图3

引文： Lavering ED， Gandhamaneni M， Weeks DL （2023）固有的无序区域不足以指导核仁蛋白在细胞核中的区室定位。PLoS 生物学 21（11）： E3002378 中。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378

学术编辑： Tom Misteli，美国国家癌症研究所

收到： 2023年3月21日;接受： 2023年10月12日;发表：十一月9 2023

数据可用性：所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

资金： EL得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）国家普通医学科学研究所（T32 GM067795）的培训资助，www.nih.gov。MG得到了爱荷华大学爱荷华州本科研究中心（ICRU）奖学金的支持。该项目得到了美国国家普通医学科学研究所、美国国立卫生研究院、www.nih.gov 的 R01 GM124063赠款以及爱荷华大学老龄化中心对 DLW 的试点资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

利益争夺：作者宣称不存在任何利益冲突。

缩写： DFC，致密的纤维状成分;CCI公司纤维中心;气相色谱，颗粒成分;印尼盾，内在无序区域;PDDF，致密纤维状成分的外围

介绍

核仁是细胞核内一个突出的非膜结合细胞器，包含多个相分离区室。非洲爪蟾卵母细胞核仁有3个可识别的核仁结构域：纤维中心（FCs）、致密纤维成分（DFCs）和颗粒成分（GC），如图1A所示[1,2]。这 3 个隔室在人类细胞中已被多次描述，但最近，第四个隔室的蛋白质组，即致密纤维成分（PDDF）的外围被提议作为人类细胞中 DFC 和 GC 之间的额外不同区域 [3]。在真核生物中，核仁是核糖体生物发生的中心。核仁的区室介导核糖体生物发生的顺序作用，从发生在FC和DFC交界处的rDNA转录开始，随着前体rRNA在DFC中被修饰而进展，随后在GC中进行核糖体组装和加工[1,4,5]。纤维蛋白（Fbl）和核磷蛋白（Npm1）分别是 DFC 和 GC 的典型结构域标记物;这两种蛋白质已被证明在体外和体内都具有相分离作用[6,7]。Fbl和Npm1在核糖体生物发生中先后发挥作用，Fbl作为pre-rRNA甲基化复合物的一部分，Npm1在核糖体蛋白组装和转运中发挥作用[8,9]。

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图 1. 核仁定位中的IDR。

（A） 3个核仁亚结构域或区室的模型。（B）野生型Ncl-GFP与Fbl-mRed共表达的生物学变异，如在四种不同的青蛙中表达，表明Ncl始终存在于GC中，有时扩散到DFC中。（C） D-F所示的蛋白质融合示意图。这些融合物中的每一种还含有绿色或红色荧光蛋白，如B所示，可以进行检测。IDR-Ncl 的净负电荷为 −40，IDR-Fbl 的净正电荷为 +17，N 端 IDR-Gar1 的净正电荷为 +7。（D-F）具有IDR嵌合体蛋白的核仁的代表性图像与与DFC核仁结构域标记物（Fbl）共表达的荧光蛋白融合。（D）显示 Fbl （IDR-Fbl-GFP）和 Ncl （IDR-Ncl-GFP）与 Fbl-mRed 共表达的内在无序区域的代表性图像。（E） IDR-Ncl 和 Fbl 融合的代表性图像，显示 IDR-Ncl-Fbl-eGFP、IDR-Ncl-ΔNFbl-eGFP 和 ΔNFbl-eGFP 均与 Fbl-mRed 共表达。*IDR-Ncl-Fbl-eGFP图像是在绿色通道中以较低的曝光度拍摄的，因为它比该组中的其他结构亮得多。（F）显示 IDR-Ncl 和 Gar1 融合的代表性图像，显示 Gar1-mCherry（定位于 DFC 的 WT）、IDR-Ncl-Gar1-mCherry、IDR-Ncl-ΔNGar1-mCherry 和 ΔNGar1-mCherry 均与 Fbl-eGFP 共表达。刻度 10 μm。统计分析如图1所示，S2数据如图2所示。DFC，致密的纤维状成分;IDR，固有无序区域。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.g001

虽然 Fbl 和 Npm1 之间的相分离先前已被表征[6]，但它们只是核仁中可以找到的数百种蛋白质中的 2 种。Hayes及其同事在先前的研究中在非洲爪蟾细胞核中发现了其他潜在的凝聚物形成核仁蛋白，他们生成了一个蛋白质名册，当可溶性蛋白质从非洲爪蟾卵母细胞的细胞核中耗尽时，这些蛋白质的扩散受到限制[7]。该名册中的许多蛋白质与体外和体内进行的其他蛋白质缩合物研究重叠[6,10,11]。尽管其他非膜结合缩合物可能具有多个独立的结构域，但核仁中的区室尤为明显。非洲爪蟾卵母细胞是研究核仁的一个特别好的系统，因为它们的尺寸很大（非洲爪蟾卵母细胞核仁的直径为5-10μm，相比之下，整个HeLa细胞的直径为10-40μm），这允许使用共聚焦荧光显微镜对未固定样品中的核仁结构域进行高分辨率可视化。此外，为了解释卵母细胞准备胚胎发生时所需的核糖体数量增加，非洲爪蟾卵母细胞包含数百个围绕染色体外 rDNA 形成的核仁。

通过相分离形成蛋白质缩合物受许多因素影响，包括蛋白质浓度、翻译后修饰、伴侣蛋白和/或小分子（如ATP）的存在以及多价相互作用的可用性[7,12,13]。在这里，我们研究了核仁蛋白的几个特征，这些特征可能有助于特定的核仁区室定位。我们检查蛋白质固有无序区域中正电荷或负电荷的普遍性，或与混合蛋白质复合物中其他蛋白质结合的能力是否足以指导区室定位。我们发现，对于测试的蛋白质，内在无序区域不足以指导核仁内的区室化。

结果

固有无序区域和核仁结构域定位

蛋白质中存在的固有无序区（intrinsically disordered region， IDR）的作用之一是驱动凝聚物和/或聚集体的形成[6,14,15]。这些区域通常具有极端的氨基酸偏倚，也称为低复杂度结构域。去除或中断某些相分离蛋白中的这些IDR可防止缩合[6,10,16–18]。例如，从 Npm1 和 Fbl 中去除 IDR 可防止它们在体外相分离 [6]。此外，一些IDR在与全长蛋白的其余部分分离时，本身能够相分离[6,19]。在Hayes及其同事鉴定的在非洲爪蟾卵母细胞核中形成凝聚物或与凝聚物相关的蛋白质中，有20多种蛋白质参与核糖体生物发生[11]。我们使用荧光蛋白融合验证了 6 种不同核仁蛋白的 DFC 定位和 8 种蛋白的 GC 定位 [5]。我们注意到，一些蛋白质似乎具有尖锐的区室边界，而另一些蛋白质则集中在一个区室中，但在整个核仁中都能检测到。使用Pondr-Fit程序（一种内在无序氨基酸的元预测因子）检查已验证区室化的蛋白质，以预测其IDR（S1表）[5,20]。这些区域也使用AlphaFold2通过可视化其结构来预测[21]。构成 2 种不同 rRNA 修饰复合物的四种蛋白质，Fbl、Nop56（盒 C/D 修饰复合物）以及 Gar1 和 Dkc1（盒 H/ACA 复合物）具有带正电荷的 IDR，而属于相同复合物的其他 3 种 DFC 定位蛋白几乎是中性的。三种主要的 GC 定位蛋白 Npm1、Bop1 和 Npm3 的 IDR 负电荷为 -19 或更高，而另外 2 种 Pes1 和 Rpl12 的负电荷更适中。据报道，两种参与大核糖体亚基组装的 GC 定位蛋白 Gtpbp4 和 Pak1ip 具有带正电荷的 IDR。Ncl 提供了一个有趣的案例，其 N 端 IDR 非常负，C 端 IDR 为正。Ncl 可以在 GC 和 DFC 中找到，但对 GC 略有偏好。新出现的趋势是，参与穿梭和前 RNA 加工的 GC 定位蛋白具有具有显着负电荷的 IDR，而 DFC 蛋白（均参与 rRNA 修饰）往往具有带正电荷的 IDR。

来自 Ncl、Fbl 和 Gar1 的 IDR 不足以指导结构域特异性

为了确定带电的 IDR 的存在是否足以驱动定位到核仁的亚结构域，我们检查了来自 Ncl 的高负 IDR 和来自 Fbl 和 Gar1 的带正电荷的 IDR。Fbl 是盒 C/D 甲基化复合物的一部分，Gar1 是盒 H/ACA 假尿苷化复合物的一部分。Fbl 和 Gar1 都定位于 DFC（图 1）。本手稿中使用的实验设计观察到通过 mRNA 注射产生的荧光标记的目标蛋白质（具有特定的改变），这些蛋白质在预先建立的核仁中加入它们的内源性对应物。在我们的研究中，我们注意到 Ncl 定位的精确模式存在一些青蛙间差异，但 Ncl 通常在 GC 中更普遍，尽管未排除在 DFC 之外（图 1B 和 S1A）。Ncl在核糖体组装和pre-rRNA转录中发挥作用，这与核仁在核仁中的更广泛分布一致[22,23]。

Ncl 在其 N 末端（残基 1-270）具有较大的 IDR，净电荷为 -40（pH 值为 7）。在Ncl N末端IDR中，有一个假定的二分核定位序列[24‒26]。该 IDR 是 Ncl 中 2 个低复杂性区域之一，另一个位于蛋白质的 C 末端，富含苯丙氨酸和甘氨酸（FG），本研究未进行测试。Fbl 在其 N 末端（残基 1-89）也有 IDR，净电荷为 +17。Gar1 在 N 和 C 末端（残基 1-64 和 143-218）均具有 IDR，净费用分别为 +7 和 +17。Fbl 和 Gar1 的 IDR 都富含精氨酸和甘氨酸（RG），但也含有 FG 序列。在这些实验中，Gar1的C端IDR没有改变。

我们测试的IDR融合示意图如图1C所示。我们首先测试了当IDRs与核仁中通常不存在的蛋白质融合时，是否会影响该蛋白质的定位。在这些研究中，绿色或红色荧光蛋白与 Fbl （IDR-Fbl）或 Ncl （IDR-Ncl）的 IDR 一起使用。IDR-Fbl-GFP在GC中积累（图1D和S1B）。其他人报道了与GFP融合的N端IDR-Fbl移动到核仁，但没有完全概括亚域定位[6,27]，我们的数据支持这一结论。IDR-Ncl-GFP也定位于核仁，但不是偏向于1个区室，而是定位于整个核仁（图1D和S1B）。我们还测试了 Fbl 和 Gar1 在没有 N 末端无序区域（ΔNFbl 和 ΔNGar1）的情况下的定位，发现 ΔNFbl 和 ΔNGar1 都通过其野生型对应物定位于 DFC（图 1E 和 1F）。我们注意到，尽管 ΔNFbl 和 ΔNGar1 都极大地有利于 DFC（图 S1B、1E 和 1F），但 ΔN 蛋白表现出轻微的（尽管具有统计学意义）扩散到 GC 中。ΔNFbl定位于DFC的能力与Feric及其同事的研究结果一致[6]。在我们的试验中，Fbl 和 Gar1 对 DFC 的定位都不需要它们的 N 末端 RG 重复固有无序区域。以前在 C 中使用 Gar1 的同源物 Garr1 的实验。线虫与我们的结果不同，在于核仁内的特定区室化。Garr1的N端结构域的去除改变了区室特异性定位[28]。如上所述，在我们的系统中，可视化的蛋白质增强了内源性蛋白质的表达，而在 C.秀丽隐杆线虫系统，他们能够分析纯合突变株。

为了进一步检验带负电荷的 IDR 会诱导 GC 定位的假设，我们将 Ncl 的大带负电荷的 IDR 融合到全长 Gar1 和 Fbl（IDR-Ncl-Gar1 和 IDR-Ncl-Fbl）以及 Gar1 和 Fbl，并去除了其 N 末端 IDR 的编码序列（IDR-Ncl-ΔNGar1 和 IDR-Ncl-ΔNFbl）。这些嵌合体定位于DFC（图1E和1F），表明与Fbl或Gar1融合的酸性无序结构域的存在不足以将这些DFC蛋白的主要区室化转移到GC中。我们再次注意到轻微的（尽管有时具有统计学意义）扩散到GC中，尽管每个嵌合体仍然强烈支持DFC定位（图1E和1F和S1B）。

1,6-己二醇破坏致密的纤维状成分蛋白，但效果并不相同

为了进一步研究核仁蛋白定位到核仁亚结构域的特性，我们用 1,6-己二醇处理卵母细胞核。据报道，1,6-己二醇是一种化合物，会破坏液滴状相分离，因为它会破坏弱疏水相互作用[29]，并且据报道，它可以减少体外Fbl水凝胶聚集[30]。

我们用 10% 1,6-己二醇处理新鲜分离的卵母细胞核，并检查了对 2 种 DFC 蛋白 Fbl 和 Gar1 的影响。在 10 分钟内，有视觉证据表明这些蛋白质分散到 GC 中，甚至可能从核仁中扩散出来。我们以10分钟标记为终点收集了多项试验的图像，发现Fbl和Gar1的反应存在差异（S2A图）[31]。虽然通常来自这两种蛋白质的荧光信号完全重叠，但 1,6-己二醇处理减少了使用 Pearson 系数（S2B 图）测量的重叠，Gar1 的组分定位比 Fbl 的受影响更大。1,6-己二醇对 Gar1 的结构域定位的影响似乎大于从核质中分离出的相分离成核仁的影响。然而，这是否是对 Gar1（或 Fbl）的直接影响，还是 1,6-己二醇对它们相互作用的其他蛋白质的影响尚不清楚。它确实表明，从带电的内在无序区域所预期的静电相互作用不足以维持蛋白质的区室化特征。

复合物结合和核仁结构域定位

参与 rRNA 假尿苷化的 H/ACA 复合物包含 4 种蛋白质：Gar1、Nhp2、Dkc1 和 Nop10（和 snoRNA）（图 2A）。我们之前发现，荧光标记的 Gar1 和 Nhp2 浓缩物存在于 DFC 中 [5]。已经研究了人Gar1与Dkc1的结合位点[32]，MacNeil及其同事在人类中发现，用丙氨酸替换序列70 VVLLG 74可显著降低Gar1与Dkc1共免疫沉淀的能力[32]。非洲爪蟾 Gar1 与人 Gar1 的比对表明非洲爪蟾 Gar1 的残基 63-67 是非洲爪蟾 Gar1 中的相应氨基酸。为了测试破坏这个假定的 Gar1 与 Dkc1 的结合位点是否会导致结构域定位的变化，我们将残基 63-67 从 VVEVG 突变为 AAAAA 以制造 Gar1M1。我们发现 Gar1M1 定位于核仁，但未集中在 DFC 中（图 2B）。

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图 2. 结合破坏后的核仁定位。

（A）盒状H/ACA复合蛋白的总体布局模型和显示破坏结合的突变位点的示意图。（B）表达野生型 Gar1-mCherry 和 Gar1 的核仁的代表性图像，其结合位点与 DKC1 （Gar1M1-mCherry）突变以及 DFC 标记物 Fbl-eGFP。还显示了野生型 Nhp2-mRed 和 Nhp2，其点突变破坏了其与 DFC 标记物 Fbl-eGFP 的 Nop10 （Nhp2P83A-mRed）的结合。在成像之前，将分离的细胞核在OR2中孵育20分钟。刻度：10μm。（C） Gar1M1-mCherry 或 Gar1-mCherry 与 Fbl-eGFP 的共定位以及 Nhp2-RFP 或 Nhp2P83A-RFP 与 Fbl-eGFP 的共定位的量化，以 Pearson 系数显示。使用 t 检验（p < 0.05）确定显着性，其中 Gar1 组的 N = 30 （Gar1）和 26 （Gar1M1）以及 Nhp2 组的 N = 24 （Nhp2）和 21 （Nhp2P83A）。这些实验用来自3种不同青蛙的卵母细胞的核仁重复进行，每次都很重要。基础数据可以在 S1 数据中找到。（D） Nhp2-mRed和Nhp2P83A-mRed的图像显示了野生型不存在的Nhp2P83A（箭头）的核仁外沉积物。刻度：20μm。DFC，致密的纤维状成分。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.g002

为了确定与盒 H/ACA 复合物的关联是否对正确的子域定位通常很重要，我们检查了 Nhp2。 Koo及其同事证明，Nhp2与盒H/ACA复合物的结合取决于结合界面高度保守的脯氨酸（脯氨酸83）[33]。从酵母到人类的生物体中，脯氨酸的重要性已通过免疫共沉淀实验和核磁共振（NMR）被证明是其与Nop10相互作用所必需的[33]。我们将脯氨酸 83 突变为丙氨酸以制造 Nhp2P83A。我们发现Nhp2P83A不再主要在DFC中积累，而是扩散到GC（图2B）。

引入结合位点可诱导致密的纤维状成分定位

Gar1 和 Nhp2 的位点特异性变化分别破坏了与 Dkc1 和 Nop10 的结合，阻止了正常定位，这表明 DFC 中某些蛋白质的积累可能取决于它们稳定形成蛋白质复合物一部分的能力。然而，如果突变改变了蛋白质进入DFC的能力，则图2中可见的分布变化也可能发生。为了检查突变的蛋白质是否仅缺乏结合伴侣来稳定它们在DFC中的保留，我们使用GFP纳米抗体将新的蛋白质结合能力引入几种蛋白质中。我们在 Gar1M1 和 Nh2P83A（分别为 Gar1M1-mRed-Nb 和 Nhp2P83A-mRed-Nb）的 RFP 融合框架内添加了抗 GFP 纳米抗体 [34]，以观察是否可以通过与 GFP 标记的 DFC 定位蛋白结合来恢复 DFC 定位。当DFC含有Fbl-eGFP时，GFP纳米抗体的加入恢复了Gar1M1和Nhp2P83A在DFC中的定位（图3A和3B）。此外，将纳米抗体添加到通常不定位于DFC的蛋白质中至少会导致部分DFC定位。当在非洲爪蟾卵母细胞中表达时，RFP 不会在核仁中积累，但当用纳米抗体（mRed-Nb）标记并与 Fbl-eGPF 共表达时，它将集中在 DFC 中（图 3C）。Npm1 是一种 GC 定位蛋白，通常似乎几乎被排除在 DFC 之外，当与纳米抗体（Npm1-mRed-Nb）融合并与 Fbl-eGFP 共表达时，它开始混合到 DFC 中（图 3C）。这支持了我们之前的结论，即复合物结合对 Nhp2 和 Gar1 在 DFC 中的积累起着重要作用，并且对于某些蛋白质来说，这些蛋白质足以在 DFC 中定向保留。

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图 3. 纳米抗体结合可诱导DFC定位。

（A）来自表达 Gar1 和 Gar1M1 核仁定位的卵母细胞的代表性核仁，以及与 GFP 纳米抗体（Nb）融合的相同蛋白质。这些蛋白质都与红色荧光蛋白融合，并与DFC标志物Fbl-eGFP共表达。（B） Nhp2 和 Nhp2P83A，有和没有纳米抗体融合，与 Fbl-eGFP 共表达。（C）单体荧光蛋白（mRed）和 Npm1 与 GFP 纳米抗体结合，与 Fbl-eGFP 共表达。对于图3中的每种情况，从3个不同的进样日中观察到35+个核仁，此处显示了代表性图像。刻度：20μm。DFC，致密的纤维状成分。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.g003

为了确定纳米抗体标记的蛋白质是否可以与细胞核内的GFP融合蛋白结合（而不是在胞质溶胶中结合，然后在已经结合的情况下定位到特定的核仁区室），我们建立了一个系统，允许在2个细胞核之间自由扩散，正如Hayes及其同事之前所做的那样[7]。在矿物油中分离表达单个目标荧光融合蛋白的卵母细胞的细胞核，以限制蛋白质从细胞核中扩散（图4A）。矿物油中的分离核保留了生理核含量（核伴侣、近似的 ATP 和盐浓度、其他小分子和潜在的共聚集体）。作为对照，我们显示了表达的蛋白质Npm1-mRed或Fbl-eGFP在融合细胞核之间的扩散，与与Fbl-eGFP共表达的抗GFP纳米抗体融合Npm1-mRed-Nb分离的细胞核相比（图4B和4C）。在融合过程开始时，每个细胞核都有一个荧光蛋白。Npm1-mRed和Npm1-mRed-Nb占据细胞核中发出红色光的GC，Fbl-eGFP在细胞核中的DFC中发出绿色光（图4B）。图像还显示，尽管这些蛋白质在核仁中的积累增强，但在核质中仍然存在显着的池。随着时间的流逝，来自每个细胞核的核仁会积累来自细胞核的荧光蛋白，即它们的融合伙伴。在Npm1-mRed和Fbl-eGFP的情况下，稳定的分布是Npm1在颗粒区室中，Fbl-eGFP在DFC中（图4C）。相比之下，使用 Npm1-mRed-Nb 的实验显示了蛋白质在 GC 和 DFC 上的分布（图 4C）。这些实验表明，用纳米抗体标记的蛋白质可以扩散到细胞核内核仁中并与GFP标记的蛋白质一起积累，并且不需要胞质结合（图4B和4C）。我们证明这对 Gar1M1 和 Nhp2P83A 都是如此（图 4C）。

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图 4. 核聚变实验。

（A）核聚变实验示意图，显示原子核在矿物油中被分离出来;2 个细胞核，每个细胞核表达不同的荧光标记蛋白，融合在一起;然后将融合的原子核添加到凡士林孔中的显微镜载玻片中进行成像。（B）以 10 分钟为间隔拍摄的荧光图像，显示荧光标记的蛋白质从 1 个细胞核扩散到与其融合的细胞核。顶行显示了含有 Fbl-eGFP 的细胞核与含有 Npm1-mRed 的细胞核融合。第二行显示了Fbl-eGFP与表达Npm1-mRed-Nb的细胞核融合的细胞核。刻度：50μm。（C） 40 分钟后在融合核连接处发现的细胞核的代表性 Apotome 荧光图像，用于每张图像上指示的蛋白质。对于图4中的每种情况，在3个不同的进样日中观察到35+个核仁，此处显示了代表性图像。刻度：20μm。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.g004

讨论

在非洲爪蟾卵母细胞中发现的核仁区室在视觉上是不同的，无论是使用电子显微镜进行测定，还是通过追踪区室特异性蛋白进行检测，如Feric及其同事和其他人（包括我们实验室的研究人员所描述的那样）[2,5,7]。每个隔室的成分与组织核糖体渐进组装的作用一致，从 rRNA 转录到 rRNA 修饰，再到 rRNA 加工和核糖体组装。Handwerger及其同事估计，核仁中蛋白质的浓度几乎是核质中蛋白质浓度的两倍[35]，并且通常认为核仁中的蛋白质与核质中的非核仁池交换[36]。核仁和核质之间的自由扩散受粒径的影响，这让人想起其他系统中核孔和P颗粒施加的扩散限制[35]。扩散到核仁和从核仁中扩散的速率受粒径的影响，但即使是1,000 kDa的颗粒似乎也能够进入和离开核仁。据报道，DFC和FC的扩散速率具有区室特异性，且比GC慢[35]。

我们对为什么蛋白质选择性地加入一个相分离结构域而不是另一个相分离结构域的理解正在不断发展。在胞质应激颗粒中，蛋白G3BP的酸性无序区域是形成多结构域应激颗粒所必需的，因为G3BP聚集被酸性IDR和RNA中负骨架之间的电荷排斥所破坏[37]。突触素和突触素的IDR的电荷差异为蛋白质凝聚物的形成提供了静电支持，该凝聚物组织了突触囊泡池[39]。这些研究，以及我们发现酸性 IDR 在 GC 中富集的发现，促使我们研究了 IDR 的电荷是否在核仁结构域定位中起驱动作用。我们最初的假设是，带负电荷的 IDR 的存在会改变 DFC 定位并将蛋白质驱动到 GC 中。在该分析中，我们使用了来自Ncl的大（31 kDa）、带负电荷（pI 4.42）的IDR。将此 IDR 添加到 Gar1 或 Fbl 并未阻止它们本地化到 DFC。将 DFC 定位蛋白 Fbl （IDR-Fbl：约 10 KDa， pI 12.34）的带正电荷的 IDR 置于 GFP 上，不会选择性地将 GFP 与 DFC 区分开来。虽然蛋白质IDR的电荷可能在核仁定位/功能中起一定作用[38]，但它们似乎不足以驱动我们测试过的蛋白质的区室定位。如图 1 所示，Ncl 在我们的系统中具有一定的可变定位。Ncl 包含在与新的第四核仁结构域 PDFC 相关的蛋白质组中。这些作者得出结论，Ncl是PDFC的高迁移率组分，我们对GC和偶尔DFC中全长蛋白的观察可能反映了从PDFC进入这些区室的难易程度[2,3]。

IDR对于相分离是否必要和充分可能取决于蛋白质及其细胞区室。对于 Fbl 和 Gar1，核仁或 DFC 特异性积累不需要 N 端 IDR 的存在，因为 ΔNFbl 和 ΔNGar1 都定位于 DFC。需要注意的是，在制备 ΔNGar1 时，我们小心翼翼地将 Gar1 上的 Dkc1 结合位点（位于 N 末端 IDR 和蛋白质有序区域之间的连接处）保持完整。但与C的研究形成鲜明对比。秀丽隐杆线虫发现去除N端或C端会改变Gar1的亚核仁分布[28]。在我们的研究中，截短的蛋白质以及这里研究的所有蛋白质都通过注射的mRNA的翻译表达，并加入了野生型蛋白质库。在 C.线虫实验中，Garr1突变体在Garr1基因组位点产生，以确保与野生型相似的表达水平。

在解释1,6-己二醇的作用时应谨慎，尤其是用于检查多组分生物系统而不是纯化蛋白质时[31,39]。然而，当用 1,6-己二醇处理细胞核时，Fbl 和 Gar1 都受到影响，尽管效果并不相同。我们发现特别有趣的是，Gar1 在 1,6-己二醇处理后仍保留在 GC 中，而 Fbl 扩散有利于转运 GC 并进入核质。1,6-己二醇干扰弱疏水相互作用。Fbl的疏水性略高于Gar1，两者分别比较了全蛋白和IDR（Fbl：36.94%，16.83%）。Gar1：26.15%，9.65%[使用Kyte和Doolittle疏水性分析[40]]找到值）。这些疏水性的差异是否解释了治疗后 Fbl 和 Gar1 的不同表型尚不清楚。Fbl 的 N 端 IDR 也包含比 Gar1 更多的 FG 重复序列。FG重复序列被认为协调通过苯丙氨酸的疏水相互作用介导的支架状相互作用，这也可能是我们观察的一个因素。然而，定位的变化是1,6-己二醇的直接影响还是间接影响很难确定。一般来说，我们认为对生物系统中发现的混合缩合物进行1,6-己二醇处理可提供有用但适度的信息。

盒式H/ACA复合物负责rRNA的假尿苷修饰，包括成熟复合物中发现的4种蛋白[41]。Dkc1与Nop10有直接相互作用，Dkc1/Nop10复合物介导Nhp2的加入，而Gar1与Dkc1有直接但相对较弱的相互作用[32,41]。该复合物的初始组装包括DKC1、Nop10和Nhp2[41,42]。第五个因素Naf1已被确定为H/ACA组装的关键因素，因为它促进Dkc1、Nop10和Nhp2相互作用以及细胞核积累，并在成熟复合物中被Gar1取代[43,44]。

尽管 Gar1 的内源性 N 端 IDR 的丢失和 Ncl 酸性 IDR 的添加都没有阻止 Gar1 主要定位于 DFC，但突变 Gar1 和 Dkc1 之间的假定结合位点导致 DFC 中 Gar1 的水平显着降低，即使突变的 Gar1 蛋白仍然存在于核仁中。这表明 Gar1 可能代表一类核仁蛋白，它们可以进入核仁，扩散到多个区室中，但只能通过与已经存在的东西结合在 DFC 中积累。与Gar1一样，Nhp2的定位在先前被证明对与Nop10相互作用很重要的保守脯氨酸残基被破坏后发生了变化[33]。这提供了第二个例子，其中结构域浓度取决于与蛋白质复合物结合的能力。我们注意到，我们试图使用非洲爪蟾卵母细胞的材料通过免疫共沉淀反应来确认 H/ACA 复合物组装被证明是有问题的。使核仁 H/ACA 复合物完好无损的提取物制备使许多核仁蛋白即使在低速离心时也可沉淀。我们的结论是，所检查的突变破坏了Gar1或Nhp2与蛋白质复合物的结合，假设非洲爪蟾复合物的行为与人类所描述的相似[33]。有趣的是，虽然突变体Nhp2P83A似乎相分离成核仁，但它也积累在核仁外斑点（图2D），这是我们在野生型Nhp2中从未见过的。这种表型可能表明，如果没有在DFC中保留，Nhp2可以占据核仁的量是有限的，尽管它仍然有利于相分离。

Gar1 和 Nhp2 的突变形式可以进入 DFC。将框内 GFP 纳米抗体与突变体融合并共表达 Fbl-eGFP 以提供一种新的结合组合，从而恢复 Gar1M1 和 Nhp2P83A 的 DFC 积累。无论卵母细胞是同时注射编码纳米抗体标记蛋白质的RNA和GFP标记的蛋白质，还是通过将细胞核融合在分别含有纳米抗体或GFP标签蛋白质的油中，情况都是如此。这表明，如果存在结合伴侣，纳米抗体标记的 Gar1M1 和 Nhp2P83A 可以集中在致密的纤维状成分中。这些研究还表明，如果提供适当的结合伴侣，通常不属于核仁中稳定蛋白质库的蛋白质，如mRed，可以在这种混合缩合物中积累。

H/ACA复合蛋白Gar1和Nhp2荧光蛋白融合的实验表达表明，这些蛋白在核仁内的池不是静态的。荧光融合蛋白成为内源性 Gar1 和 Nhp2 池的一部分，并加入现有的核仁。我们在这里注意到，我们无法证明复合物的另外 2 个成员 Dkc1 或 Nop10 的荧光蛋白融合模仿了这种行为。尽管注射编码 Dkc1 和 Nop10 荧光融合的 mRNA 会产生移动到细胞核的蛋白质，但核仁中的任何积累都低于我们的检测能力。当Dkc1 mRNA被注射到胚胎中时，情况并非如此。盒式H/ACA复合物通常表示为由Dkc1、Nop10、Nhp2和Gar1的化学计量水平组成，这4种蛋白质在非洲爪蟾卵中的浓度估计值在20%以内[45]。这一观察结果表明，对RNA修饰复合物（如盒H/ACA复合物）的建模可能需要包括核仁如何对可容纳的复合物总数建立限制。该模型还必须允许基于缩合物的复合物中的某些蛋白质快速交换，而其他蛋白质则不然。

是什么锚定了DFC？之前已经提出了一种相分离的支架-客户端模型，其中一种蛋白质相分离，其他蛋白质能够加入该相，因为它们可以与支架相互作用[46]。该模型已用于描述将可溶性蛋白质添加到相分离缩合物中，其中可溶性蛋白质不能单独进行相分离。对于多室核仁，支架/客户端分离可以解释DFC和GC之间的分离，其中已经相分离的蛋白质只有在能够与现有支架结合时才能在DFC中积累。如果核仁遵循相分离的支架-客户模型，那么 Gar1 和 Nhp2 似乎都是客户蛋白。H/ACA 复合物的潜在支架蛋白可能是 Dkc1。人们还可以想象，如果 Fbl 的一部分与像 rRNA 这样的共聚集体结合，可能会作为盒式 C/D 复合物的支架，而 Fbl 池的一部分则处于更动态的交换中。Fbl 或 Dkc1 或其他一些核仁成分的支架作用正在等待实验验证。

材料与方法

道德声明

所有协议均由爱荷华大学动物资源办公室和机构动物护理和使用委员会（协议#0121363）批准。

卵母细胞取出和制备

如前所述，通过手术从非洲爪蟾中取出卵母细胞，并准备进行检测[5]。简而言之，在无菌切除卵巢之前，将青蛙在0.8%至0.1%的三卡因浴中麻醉15分钟。在一些试验中，从卵母细胞中手动取出卵泡细胞，并在几小时后向卵母细胞注射mRNA。其他试验使用胶原酶（Worthington，1型）进行脱毛的卵母细胞。任何残留的卵泡细胞都用制表镊子手动去除。胶原酶处理的卵母细胞在卵母细胞培养基中13°C过夜，然后进一步处理[47]。非洲爪蟾购自非洲爪蟾-1（美国密歇根州德克斯特）。

蛋白质融合cDNA的构建

编码用mRed或eGFP标记的Npm1和Fbl荧光融合的cDNA是Cliff Brangwynne实验室（新泽西州普林斯顿大学）的礼物。其他野生型核仁蛋白的cDNA购自TransOmic Technologies，荧光融合还包括GFP（mGFP5 [48]）和mCherry [49]。如前所述[5]。如前所述，将所有构建体放入RN3P质粒骨架（来自英国剑桥大学John Gurdon的礼物）中，并使用NEB的Q5 PCR和Gibson的组装（New England Biolabs，E5510S）组装编码IDR的序列[5]。需要注意的是，虽然 Gar1 的 N 末端 IDR 被预测为残基 1-64，但 Gar1 与 DKC1 的结合位点从残基 63 开始。为了保留该结合位点，通过删除 Gar1 的残基 1–60 来制备 ΔNGar1。Ncl 的 IDR 是残基 1-270，Fbl 的 IDR 是残基 1-89。

Gar1M1 是使用模板 Gar1-mCherry 和 Gar1-GFP [5] 制作的。使用定点诱变（NEB 的 KLD 反应混合物，M0554）将残基 63-67 从 VVEVG 更改为 AAAAA。Nhp2P83A 是通过以相同的方式将 Nhp2 中的脯氨酸 83 变为丙氨酸来制备的。在KLD反应或Gibson组装后，质粒在NEB Stable Competent E中转化。大肠杆菌细胞（用于 Gar1 和含有 Ncl 的融合物，C3040H）或 NEB 的 5 α E。大肠杆菌细胞（对于所有其他融合，C2987H）。对于纳米抗体实验，编码“增强子”纳米抗体的cDNA来自Kubala及其同事，购自Addgene[34]。使用PCR扩增增强子，并使用Gibson Assembly添加到先前制备的RFP标记蛋白质克隆的C末端。参见 S2 表，了解每种融合的引物和荧光蛋白列表。所有构建体均通过测序（爱荷华大学基因组学核心）进行验证。

mRNA体外合成和注射到卵母细胞中

NEB 的 Q5 PCR 用于使用引物 m13F 和 m13R 创建用于体外转录的线性模板。mRNA 是使用 mMessage mMachine 的 T3 体外转录试剂盒使用推荐方案（Ambion）制备的。使用琼脂糖凝胶电泳分析验证了mRNA的产生，并使用Nanodrop分光光度计（Thermo Scientific）测定浓度。将等分试样储存在-80°C直至使用，如前所述，使用Singer MK-1、玻璃针头和Inject+Matic注射器（瑞士日内瓦）将10nL浓度为100ng/μL的mRNA直接注射到V-VI期卵母细胞中[5]。使用 GFP（Living Colors，JL-8）和 RFP（Chromotek，6G6）抗体进行 SDS PAGE 分析和免疫印迹验证荧光融合的表达。为了估计添加到内源性池中的蛋白质量，我们比较了 Ncl-GFP 与内源性 Ncl 的表达，该单克隆抗体由 Max-Plank-Institut fure Entwicklungsbiologie 的 C. Dreyer 开发，该抗体来自发育研究杂交瘤中心，由 NIH 的 NICHD 创建并在爱荷华大学生物系维护，爱荷华州爱荷华市 52242。这些试验表明，在所描述的条件下，内源性蛋白质库增加了5%至20%。

Apotome荧光显微镜

在卵母细胞林格斯溶液（OR2、82.5 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM CaCl2，1毫米氯化镁2，1 毫米钠2HPO（HPO）4，5mM HEPES和NaOH至pH 7.8）在解剖显微镜下。将分离的细胞核置于凡士林孔中的显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖，并使用运行Axio Vision软件（RRID：SCR_002677）的AxioPlan或ApoTome荧光显微镜和AxioCam Mrm或AxioCam MrC5相机（Zeiss）对漂移到细胞核底部的核仁进行成像，如前所述[5]。当指示时（如图2所示），细胞核在成像前在OR2培养皿中停留20分钟，以使可溶性蛋白质扩散。当可溶性蛋白质（注入的荧光融合物）的背景辉光使得对核仁的清晰成像具有挑战性时，就会完成这项工作。对扩散 20 分钟后拍摄的图像和立即成像的图像的分析都产生了 WT 与突变的显着差异，如图 2 所示（S1 数据）。一些青蛙含有具有核仁的卵母细胞，绿色背景信号最小。需要时，将数据集归一化为未注射绿色荧光蛋白的对照组。

1,6-己二醇处理

在OR2中手动分离细胞核，并立即移动（同时注意保持核膜完整）到含有溶解在OR2中的10%1,6-己二醇溶液（Sigma-Aldrich）溶液的培养皿中。将细胞核在室温下在1,6-己二醇中孵育10分钟。然后将细胞核放在凡士林孔中的显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖并立即成像。

共定位图像分析

使用Pearson系数的共定位图像分析来评估Gar1M1和Nhp2P83A与DFC标记物（Fbl）的重叠，如图2所示，并评估1,6-己二醇处理后的Gar1/Fbl重叠，如图2所示。为此，图像围绕单个原子核进行裁剪，然后在 ImageJ 中拆分通道。然后使用 ImageJ 中的 JACoP 插件来评估对照组和治疗组之间的 Pearson 系数组。所有图表均已制作，所有统计分析均使用GraphPad Prism完成（第< 0.05页）。这些实验用来自3个不同青蛙的卵母细胞重复至少3次，并切换荧光标签（Gar1用红色荧光蛋白标记，Fbl用绿色荧光蛋白标记，反之亦然），每次都发现显着。请参阅 S1 数据和 S3 数据。使用Pearson系数的共定位也用于评估不同日期的Ncl-GFP和Fbl-RFP重叠，如S1图（S2数据）所示。

Spaulding及其同事[28]先前描述的变异系数（如图1所示）量化了每个内在无序区域嵌合体在核仁内定位的变化。简而言之，图像被分成荧光通道，并为每个通道选择单独的核仁，并getRawStatistics（N，平均值，最小值，最大值，std）和print（std/mean）; 命令用于确定每个荧光标记物的变异系数。这些数据的摘要可以在 S1 图和 S2 数据中找到。

核聚变实验

向卵母细胞注射编码红色荧光标记蛋白或绿色荧光标记蛋白的 mRNA。在允许蛋白质表达24至72小时后，在轻质矿物油培养皿（Sigma-Aldrich 33079）中手动分离细胞核。在 2 个细胞核（1 个含有 GFP 标记的蛋白质和 1 个含有 RFP 标记的蛋白质）的核膜中形成一个小撕裂，在撕裂点融合在一起的细胞核。然后将融合的原子核小心地放在凡士林孔中的显微镜载玻片上，并用盖玻片覆盖。使用荧光显微镜每 10 分钟对融合的原子核进行成像，持续 40 分钟。40分钟后，使用ApoTome荧光显微镜在更高的放大倍率下对核仁进行成像。

支持信息

图1的统计分析。

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S1 图。图1的统计分析。

（A）使用皮尔逊系数进行统计分析，使用单因素方差分析多重比较检验，评估荧光标记的 Ncl 与荧光标记的 Fbl 在 4 个不同日期的重叠，p < 0.05。第 1-4 天的 N = 15、58、52 和 24。（B）显示统计分析结果的表格，比较左栏所示条件的变化系数。重复“1、2 和 3”表示每种情况的不同青蛙/注射天数。列中的值不一定是同一天的值（数据应水平读取，而不是垂直读取）。P < 0.05，N 值在 15–62 之间。基础数据可以在 S2 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.s001

（TIF）

S2 图。 Fbl 和 Gar1 对 1,6-己二醇处理的反应。

（A）在 OR2 中分离并在 10% 1,6-己二醇中浸泡 10 分钟的细胞核中表达 Gar1-GFP 和 Fbl-mRed 的核仁的代表性图像。（B）使用含己二醇和不含己二醇（p < 0.05）、N = 35（对照）和 33（己二醇）的 Gar1 和 Fbl 之间的皮尔逊系数分析共定位。用来自3种不同青蛙的卵母细胞的核仁重复该实验，并切换荧光标签。基础数据可在 S3 数据中找到。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.s002

（TIF）

S1 表。疾病预测和核仁定位。

第 1 列：蛋白质名称。第 2 列：固有无序区域（IDR）的 Pondr-FIT 预测，X 轴上有残基数，Y 轴上有预测的无序（>0.5）。第 3 列：具有 IDR 的一级序列（如 Pondr-FIT、Xue 及其同事 [20] 预测的那样）以黄色突出显示，本文中突变的 Gar1 和 Nhp2 的推定结合位点以红色显示。第 4 列：蛋白质的核仁定位，主要基于 Lavering 及其同事（2022） [5]。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.s003

（文件）

S2 表。克隆引物。

该表显示了用于制备论文中所示构建体的引物以及每个构建体中的荧光蛋白。它们是使用 Gibson Assembly 或 Q5 定点诱变制成的，如副标题所示。*这些仅通过使用给定的引物、Q5 PCR 扩增感兴趣的区域并使用扩增的区域作为 mRNA 转录的模板来制备。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.s004

（文件）

S1 数据。 Gar1M1-mCherry 或 Gar1-mCherry 与 Fbl-eGFP 的共定位以及 Nhp2-RFP 或 Nhp2P83A-RFP 与 Fbl-eGFP 的共定位的定量，如图 2 所示，以 Pearson 系数显示。

使用 t 检验（p < 0.05）确定显着性，其中 Gar1 组的 N = 30 （Gar1）和 26 （Gar1M1）以及 Nhp2 组的 N = 24 （Nhp2）和 21 （Nhp2P83A）。用来自3种不同青蛙卵母细胞的核仁重复这些实验，每次都很重要（补充数据文件：S1_Data.xlsx）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.s005

（XLSX）

S2 数据。使用皮尔逊系数进行统计分析，使用单因素方差分析多重比较检验，评估荧光标记的 Ncl 与荧光标记的 Fbl 在 4 个不同日期的重叠，p < 0.05。

第 1-4 天的 N = 15、58、52 和 24（图 1D、1F、S1A 和 S1B 的补充数据文件可在以下位置找到：S2_Data.xlsx）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.s006

（XLSX）

S3 数据。比较 Fbl/Gar1 在处理和不处理 1,6-己二醇的情况下的共定位（皮尔逊系数），如图 S2 所示。

使用含和不含己二醇（p < 0.05） N = 35（对照）和 33（己二醇）的 Gar1 和 Fbl 之间的皮尔逊系数分析共定位。用来自3种不同青蛙卵母细胞的核仁重复该实验，并切换荧光标签（补充数据文件：S3_Data.xlsx）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002378.s007

（XLSX）

确认

Fbl 和 Npm1 荧光融合蛋白是 Cliff Brangwynne 实验室（普林斯顿大学）的礼物。用作荧光融合蛋白骨架的RN3P质粒是John Gurdon（剑桥大学）的礼物。阿什利·戈尔（Ashley Gol）和伊里尼·佩特罗斯（Irini Petros）提供了技术援助。我们感谢爱荷华大学神经退行性疾病代谢（MIND）联盟的合作者以及爱荷华大学生物科学和分子聚合网络（MAggNET）联盟的 Jan Fassler、Bryan Phillips 和 Dan Summers 提供的有益讨论和编辑建议。

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